background-image: url(img/AGENTEM-slide_title_background-16_9-1210_681.png) .agentem-title-slide[ .pull-right[ .center[ DNA İzolasyonu MYKU-I Ders Sunumu ] ] ] .header-card[ .center[ .can-edit[ Abdullah HANTA<br> Ç.Ü. Biyoteknoloji Y.Lisans<br> Danışman: Prof.Dr. Sevcan TUĞ BOZDOĞAN<br> Ç.Ü. AGENTEM<br> ] ] ] --- class: center ## Hakkımda <img style="border-radius: 50%;" src="img/ah.jpeg" width="160px"/> ### Abdullah HANTA ### Moleküler Biyolog ##### links: [<svg aria-hidden="true" role="img" viewBox="0 0 640 512" style="height:1em;width:1.25em;vertical-align:-0.125em;margin-left:auto;margin-right:auto;font-size:inherit;fill:currentColor;overflow:visible;position:relative;"><path d="M579.8 267.7c56.5-56.5 56.5-148 0-204.5c-50-50-128.8-56.5-186.3-15.4l-1.6 1.1c-14.4 10.3-17.7 30.3-7.4 44.6s30.3 17.7 44.6 7.4l1.6-1.1c32.1-22.9 76-19.3 103.8 8.6c31.5 31.5 31.5 82.5 0 114L422.3 334.8c-31.5 31.5-82.5 31.5-114 0c-27.9-27.9-31.5-71.8-8.6-103.8l1.1-1.6c10.3-14.4 6.9-34.4-7.4-44.6s-34.4-6.9-44.6 7.4l-1.1 1.6C206.5 251.2 213 330 263 380c56.5 56.5 148 56.5 204.5 0L579.8 267.7zM60.2 244.3c-56.5 56.5-56.5 148 0 204.5c50 50 128.8 56.5 186.3 15.4l1.6-1.1c14.4-10.3 17.7-30.3 7.4-44.6s-30.3-17.7-44.6-7.4l-1.6 1.1c-32.1 22.9-76 19.3-103.8-8.6C74 372 74 321 105.5 289.5L217.7 177.2c31.5-31.5 82.5-31.5 114 0c27.9 27.9 31.5 71.8 8.6 103.9l-1.1 1.6c-10.3 14.4-6.9 34.4 7.4 44.6s34.4 6.9 44.6-7.4l1.1-1.6C433.5 260.8 427 182 377 132c-56.5-56.5-148-56.5-204.5 0L60.2 244.3z"/></svg> My Website](https://ahprojects.github.io/) [<svg aria-label="GitHub" role="img" viewBox="0 0 496 512" style="height:1em;width:0.97em;vertical-align:-0.125em;margin-left:auto;margin-right:auto;font-size:inherit;fill:currentColor;overflow:visible;position:relative;"><title>GitHub</title><path d="M165.9 397.4c0 2-2.3 3.6-5.2 3.6-3.3.3-5.6-1.3-5.6-3.6 0-2 2.3-3.6 5.2-3.6 3-.3 5.6 1.3 5.6 3.6zm-31.1-4.5c-.7 2 1.3 4.3 4.3 4.9 2.6 1 5.6 0 6.2-2s-1.3-4.3-4.3-5.2c-2.6-.7-5.5.3-6.2 2.3zm44.2-1.7c-2.9.7-4.9 2.6-4.6 4.9.3 2 2.9 3.3 5.9 2.6 2.9-.7 4.9-2.6 4.6-4.6-.3-1.9-3-3.2-5.9-2.9zM244.8 8C106.1 8 0 113.3 0 252c0 110.9 69.8 205.8 169.5 239.2 12.8 2.3 17.3-5.6 17.3-12.1 0-6.2-.3-40.4-.3-61.4 0 0-70 15-84.7-29.8 0 0-11.4-29.1-27.8-36.6 0 0-22.9-15.7 1.6-15.4 0 0 24.9 2 38.6 25.8 21.9 38.6 58.6 27.5 72.9 20.9 2.3-16 8.8-27.1 16-33.7-55.9-6.2-112.3-14.3-112.3-110.5 0-27.5 7.6-41.3 23.6-58.9-2.6-6.5-11.1-33.3 2.6-67.9 20.9-6.5 69 27 69 27 20-5.6 41.5-8.5 62.8-8.5s42.8 2.9 62.8 8.5c0 0 48.1-33.6 69-27 13.7 34.7 5.2 61.4 2.6 67.9 16 17.7 25.8 31.5 25.8 58.9 0 96.5-58.9 104.2-114.8 110.5 9.2 7.9 17 22.9 17 46.4 0 33.7-.3 75.4-.3 83.6 0 6.5 4.6 14.4 17.3 12.1C428.2 457.8 496 362.9 496 252 496 113.3 383.5 8 244.8 8zM97.2 352.9c-1.3 1-1 3.3.7 5.2 1.6 1.6 3.9 2.3 5.2 1 1.3-1 1-3.3-.7-5.2-1.6-1.6-3.9-2.3-5.2-1zm-10.8-8.1c-.7 1.3.3 2.9 2.3 3.9 1.6 1 3.6.7 4.3-.7.7-1.3-.3-2.9-2.3-3.9-2-.6-3.6-.3-4.3.7zm32.4 35.6c-1.6 1.3-1 4.3 1.3 6.2 2.3 2.3 5.2 2.6 6.5 1 1.3-1.3.7-4.3-1.3-6.2-2.2-2.3-5.2-2.6-6.5-1zm-11.4-14.7c-1.6 1-1.6 3.6 0 5.9 1.6 2.3 4.3 3.3 5.6 2.3 1.6-1.3 1.6-3.9 0-6.2-1.4-2.3-4-3.3-5.6-2z"/></svg> @ahprojects](https://github.com/ahprojects) --- # Özet ## - DNA nedir? Temel özellikleri nelerdir? ## - DNA nerede bulunur? ## - DNA izolasyonun aşamaları nelerdir? ## - DNA izolasyonunun çeşitleri nelerdir? --- ## DNA'nın Temel Özellikleri .pull-left[ ### - .black[Adenin, Guanin, Sitozin ve Timinden olusur] ### - .black[Negatif yüklüdür.] ### - .black[Dayanıklı bir yapısı vardır.] ### - .black[Suda çözünür alkolde çözünmez] ### - .black[Her türlü hücreden izole edilebilir.] ] .pull-right[ <div class="figure"> <img src="https://cutt.ly/TMnIB7C" alt="<a href="https://cutt.ly/TMnIB7C">source:wikimedia.org</a>" width="45%" /> <p class="caption"><a href="https://cutt.ly/TMnIB7C">source:wikimedia.org</a></p> </div> <div class="figure"> <img src="https://cutt.ly/kMnO4SG" alt="<a href="https://cutt.ly/kMnO4SG">source: bilimgenc.tubitak.gov.tr</a>" width="45%" /> <p class="caption"><a href="https://cutt.ly/kMnO4SG">source: bilimgenc.tubitak.gov.tr</a></p> </div> ] --- ## DNA nerede bulunur? .pull-left[ ### .black[Nükleus] ### .black[Mitokondri] ### .black[Kloroplast] ] .pull-right[ <img src="img/image5.png" width="100%" /> ] --- # .center[İzolasyon Aşamaları] .pull-left[ ### .green2[Lizis:] .black[Hücrelerin Parçalanması <br> (Fiziksel ya da Kimyasal)] ### .green2[Pürifikasyon:] .black[DNA-Protein kompleksinin çözünmesi] ### .green2[Presipitasyon :] .black[DNA’nın ortamdaki diğer moleküllerden uzaklaştırılması] ] .pull-right[ <div class="figure"> <img src="https://cutt.ly/ZMnPRiu" alt="<a href="https://cutt.ly/ZMnPRiu">source: molekulerbiyolojivegenetik.org/</a>" width="110%" /> <p class="caption"><a href="https://cutt.ly/ZMnPRiu">source: molekulerbiyolojivegenetik.org/</a></p> </div> ] --- layout: true # İzolasyon Alanları --- .center[ <div class="figure"> <img src="img/image7.png" alt="<a href="https://cutt.ly/9MnP58S">source: nucleogene.com</a>" width="60%" /> <p class="caption"><a href="https://cutt.ly/9MnP58S">source: nucleogene.com</a></p> </div> ] --- .center[ <img src="img/image8.jpg" width="70%" /> ] --- layout: true # İzolasyon Metodları --- .center[ <div class="figure"> <img src="img/image9.jpeg" alt="source: GeneticEducation Inc." width="60%" /> <p class="caption">source: GeneticEducation Inc.</p> </div> ] --- .pull-left[ <div class="figure"> <img src="https://cutt.ly/gMnRoUV" alt="<a href="https://cutt.ly/gMnRoUV">source: www.dabasmuzejs.gov.lv</a>" width="45%" /> <p class="caption"><a href="https://cutt.ly/gMnRoUV">source: www.dabasmuzejs.gov.lv</a></p> </div> <div class="figure"> <img src="https://cutt.ly/4MnDrSx" alt="<a href="https://cutt.ly/4MnDrSx">source: https://www.medilabsecure.com/</a>" width="45%" /> <p class="caption"><a href="https://cutt.ly/4MnDrSx">source: https://www.medilabsecure.com/</a></p> </div> ] .pull-right[ <img src="img/image11.png" width="100%" /> ] --- .center[ <img src="img/image13.jpg" width="50%" /> Petra Korlević, Erica McAlister, Matthew Mayho, Alex Makunin, Paul Flicek, Mara K N Lawniczak <br> [A Minimally Morphologically Destructive Approach for DNA Retrieval and Whole-Genome Shotgun Sequencing of Pinned Historic Dipteran Vector Species, Genome Biology and Evolution, Volume 13, Issue 10, October 2021, evab226,](https://doi.org/10.1093/gbe/evab226) ] --- .center[ <img src="https://cutt.ly/MMnCWLV" width="45%" /> ] Wei-Kai Wu, Chieh-Chang Chen, Suraphan Panyod, Rou-An Chen, Ming-Shiang Wu, Lee-Yan Sheen, Shan-Chwen Chang, [Optimization of fecal sample processing for microbiome study — The journey from bathroom to bench,Journal of the Formosan Medical Association,Volume 118, Issue 2, 2019,Pages 545-555,ISSN 0929-6646](https://doi.org/10.1016/j.jfma.2018.02.005) --- layout: false .center[ <div class="figure"> <img src="https://cutt.ly/mMnNrOQ" alt="<a href="https://cutt.ly/mMnNrOQ">source: en.wikipedia.org/wiki/Human_microbiome</a>" width="50%" /> <p class="caption"><a href="https://cutt.ly/mMnNrOQ">source: en.wikipedia.org/wiki/Human_microbiome</a></p> </div> ] --- layout: true # İzolasyon Metodları --- .pull-right[ <img src="https://cutt.ly/vMn0rx8" width="110%" /> ] .pull-left[ .black[ Takamatsu, Takeshi & Baslam, Marouane & Inomata, Takuya & Kazusato, Oikawa & Itoh, Kimiko & Ohnishi, Takayuki & Kinoshita, Tetsu & Mitsui, Toshiaki. (2018).] <br> [Optimized Method of Extracting Rice Chloroplast DNA for High-Quality Plastome Resequencing and de Novo Assembly. Frontiers in Plant Science. 9.](https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00266) [Scientific Figure 1 ](https://cutt.ly/vMn0rx8) ] --- layout: false # DNA izolasyonu aşamaları <div class="figure"> <img src="img/image18.png" alt="<a href="https://cutt.ly/9MnP58S">source: nucleogene.com</a>" width="130%" /> <p class="caption"><a href="https://cutt.ly/9MnP58S">source: nucleogene.com</a></p> </div> --- layout: true # Lizis --- -- ## .black[Hücrenin parçalanarak DNA’ya ulaşmamızı sağlayan ilk aşamadır.] -- ### - Kaotropik Tuzlar -- ### - Deterjanlar -- ### - Enzimler --- ### - .purple1[EDTA’lı Kan :] .black[*Mg* bağlar **DNA**’yı stabilize eder, **Dnase**’ın etkisi engellenir] -- ### - .purple1[Tris Edta (TE):] .black[**TE** eritrositlerin parçalanmasını sağlar] -- ### - .purple1[Sodyum Deodosil Sülfat (SDS):] .black[Deterjan türevidir,hücre zarındaki lipidlerin parçalanmasını sağlayarak hücre zarının geçirgenliğini arttırarak hücrenin yapısını bozar.] --- ### - .purple1[NaCl:] .black[Tuz hücre zarından girerek **DNA**’yı proteinlerden ayırır.] -- ### - .purple1[Proteinaz K:] .black[Proteinleri parçalayarak homojen bir yapı ortaya çıkarır.] -- ### - .purple1[Rnase:] .black[**RNA**’ların parçalanarak ortamdan uzaklaşmasını sağlar.] --- layout: true ## Pürifikasyon --- ### - .black[Lizatın üzerine 250 μl Fenol 250 μl Kloroform eklenir, karıştırılır. 2500 rpm de 2 dk. Santrifüj edilir.] -- ### - .black[Üst faz başka tüpe alınır alt faz atılır.] -- ### - .black[Üst faz ile aynı işlem iki sefer daha tekrarlanır.] -- ### - .black[Fenol proteinleri degrade ederken, kloroform gradient farkı yaratarak DNA’nın fenol ve parçalanmış atıklarla beraber dibe çökmesini engeller. .fn[1] ] .footnote[[1]Fenol kloroform proteinlerin uzaklaştırılmasını sağlar.] --- ### - .black[Fenolle proteinler denatüre edilerek ortamdan uzaklaşmaları sağlanır.] ### - .black[Kullanılan fenolün pH’sı önemlidir;] ### * .black[alkali pH’ta (pH 8.0) RNA’lar uzaklaştırılırken] ### * .black[asidik pH’ta (pH 5.0) DNA’lar uzaklaştırılır] --- layout: true ## Presipitasyon --- ### 1. .black[Absolut soğuk alkol ile presipitasyon(çökeltme) yapılır (+santrifüj)] ### 2. .black[%70’lik *alkol* ile **DNA** yıkanır (proteinler uzaklaştırılır)] ### 3. .black[**DNA** ***Tris-Edta*** ile çözdürülüp saklanır.] ### .purple1[A. **DNA**’nın kimyasal olarak çöktürülmesi: ***Etanol***] #### .purple1[A.1. Çökelmeyi artırıcı bazı kimyasallar ***İzopropanol***] ### .purple1[B. **DNA**’nın fiziksel olarak çöktürülmesi: ***Santrifüj***] --- ### .black[Son ***fenol*** muamelesinden sonra farklı tüpe alınan **DNA** içeren üst faza soğuk % 99’luk ***etanol*** eklenir ve **DNA** çöktürülür.] ### .black[Soğuk ***etanol***de **DNA** tüm diğer moleküllerden (degrade olmuş veya olmamış **RNA**, **protein** parçaları, ***fenol*** kalıntısı gibi) daha hızlı çökelir.] --- layout: true # Manuel DNA izolasyonu --- ### Uygulama Basamakları #### 1. Hazırlanan lizis solüsyonundan hücre peletinin üzerine 2 mL eklenir. 37°C ‘de bir gece bekletilir. #### 2. 1 mL doygun ***NaCl*** eklenir. #### 3. Örnekler 55°C 10 dakika bekletilir. #### 4. 30 dakika 500 g’de santrifüj edilir. #### 5. Alttaki **protein** yapidaki bölümüne dokunmadan süpernatant yeni bir tüpe aktarılır. #### 6. Süpernatantın 2 katı hacimde soğuk %96’lık ***etanol*** eklenir. Tüp defalarca alt üst edilerek **DNA**’nın çökmesi sağlanır. --- #### 7. Çöken **DNA** plastik spatula ya da santrifüj ile alınarak yeni bir tüpe aktarılır. Santrifüj yapılacak ise 10000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır. #### 8. %70’lik alkol ile **DNA** bir kez yıkanır. Bunun için 1 mL %70’lik alkol eklenir. Tüp alt üst edilir. 10000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır. #### 9. **DNA** havada kurutulur. #### 10. Distile suda **DNA** çözülür. Çözülmesini kolaylaştırmak için 65C’de 10 dakika tutulur. #### 11. Elde edilen **DNA** dan 1/25 -1/40 dilüsyon hazırlanır. A280/A260 oranı ölçülür .fn[1] .footnote[[1]-A280/A26 oranının 1.5'den büyük olması DNA saflığının yeterliliğini belirtir.] --- ### SPEKTROFOTOMETRİ .pull-left[ - **OD** (optik yoğunluk değeri, absorbans) - **OD** ***260/280*** oranı örnek temizliğini gösterir<br>(1.8 ideal oran) - ***260nm*** nükleik asitler - ***280nm*** proteinler - **OD < 1.8** protein .red[kontaminasyonu] - **OD > 1.8** nükleik asit .red[kontaminasyonu] ] .pull-right[ <img src="img/image20.jpg" width="110%" /> ] ??? Sunum notlari o --- layout: true class: center, middle # Thanks! Template created by [Abdullah HANTA](https://ahprojects.github.io/) Slides created via the R packages: [**xaringan**](https://github.com/yihui/xaringan)<br> [gadenbuie/xaringanthemer](https://github.com/gadenbuie/xaringanthemer) [gadenbuie/xaringanExtra](https://github.com/gadenbuie/xaringanExtra) The chakra comes from [remark.js](https://remarkjs.com), [**knitr**](http://yihui.name/knitr), and [R Markdown](https://rmarkdown.rstudio.com). ---